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No.14 色谱柱压力升高时
HPLC在使用过程中,经常会遇到的问题之一就是压力的升高。据此我们以反相分离为例,介绍压力升高时的解决方法。
压力升高时,首先将色谱柱取下通液,判断系统压力是否过高。系统压过高的情况,多数为配管等发生堵塞引起的。系统压力正常的情况,则应该是色谱柱问题。此时应考虑清洗色谱柱。使用反冲时有可能会得到好的冲洗效果,反冲时需要注意不可接检测器,同时需注意流速与压力的控制。
一般推荐提高有机溶剂浓度比例进行清洗,但最好根据样品的溶解性选择合适溶剂。比如:反相分离时,如是因样品中蛋白吸附引起的压力升高,此时使用含有0.1%TFA的乙腈水溶液进行梯度洗脱会更有效(须注意色谱柱的适用pH范围)。
怀疑样品中有不溶物或分离过程中有样品析出的,建议清洗或更换色谱柱的筛板。 实际上,色谱柱压力一旦升高,想要通过清洗使柱效等恢复是比较困难的。为了降低柱压升高的可能性,建议充分过滤样品,做好除蛋白等大分子的前处理(尤其是制剂类产品中的辅料预处理),必要时使用保护柱等。