方法开发指南
关于HPLC分析方法的开发，常常需要专业的知识与经验，且需要消耗大量的时间与劳动力。如果方法可以进行快速开发的话，将会提升研发速度。本指南通过将分析条件筛选进行程序化设计，使初学者亦可轻松快速的进行方法开发。
影响分离方法开发的三大要素
如图所示，化合物的性质、固定相（色谱柱/填料）与流动相是左右方法开发的关键因素。通常状况分离物是不可以变更的，因此主要通过调整固定相与流动相进行方法开发。
分析方法开发流程
进行分析方法开发前，先进行化合物、分析条件等的信息收集。如果有分析案例的话，可参考对应案例进行方法优化。如果没有案例可参考时，进行方法筛选会是一个不错的手段。方法筛选是通过流动相与色谱柱等进行交叉组合筛选实现。进行方法筛选时，通过基本条件的设定，可以快速找到适合的流动相条件与色谱柱规格，从而实现快速的方法开发。
反相分离方法的开发
Step 1 方法探索
反相HPLC方法筛选中，除流动相中的有机溶剂外缓冲溶剂（水溶液）的pH也对分离有明显影响，因此应筛选的项目较多。鉴于需要探讨的项目偏多，为了缩短分析时间选用50mm的短柱进行方法开发会更为高效。具有良好峰形与卓越耐久性的Triart系列产品因备有丰富的尺寸型号供选择，因此非常适用于进行方法筛选。通过将Triart色谱柱、有机溶剂、流动相pH进行组合，可快速实现方法初探。
色谱柱与流动相基本条件的选择
分离方法最佳化（最终方法的设定）
Step 2 条件最佳化
根据方法初探的结果进行色谱条件最佳化。为改善分离度、保留时间等从而实现方法最佳化，对流动相占比、梯度斜率、是否添加第二种有机溶剂、柱温等进行探讨。
优化流动相占比、梯度斜率
进行复杂成分的分析时，梯度洗脱可能是更为高效的方法，只是每次分析需要有足够的平衡时间以便实现重现性。进行梯度条件优化时，保留最强组分的洗脱依赖于梯度条件的最终占比，弱保留物质的保留依赖于梯度的初始设定。通常情况下，通过调缓梯度斜率提升分离度、调陡梯度斜率以使峰尽快流出，从而实现分离的改善和分析时间的缩短。
根据方法初探的梯度结果判断需要实施等度洗脱时，根据经验可将梯度条件下首先洗脱出的峰对应的有机溶剂浓度调低20%查看效果。
市售感冒药提取液的分析，梯度斜率最佳化案例
| Column | Hydrosphere C18 (5 μm,12 nm) 150 X4.6 mmI.D. |
|---|---|
| Eluent | A) 20 mM phosphate buffer (pH 2.5) B) methanol |
| Flow rate | 1.0 mL/min |
| Temperature | 37 ℃ |
| Detection | UV at 210 nm(0-15 min), 235 nm (15-25 min) |
- Thiamine hydrochloride
- Unknown
- L-Ascorbic acid
- Maleic acid
- dl-Methylephedrinehydrochloride
- Dihydrocodeinephosphate
- Saccharin sodium
- Caffeine
- Chlorpheniramine
- Ibuprofen
第2种有机溶剂的添加
当需要进一步改善分离时，也可通过加THF等第2种有机溶剂查看效果。通常做法为保持有机溶剂总占比不变，改变其中一部分为第2种有机溶剂，即通过变更选择性改善分离。
